沙丁胺醇檢測試劑盒技術(shù)指導(dǎo)

（酶聯(lián)免疫法）

 1 原理及用途

本試劑盒采用間接競爭ELISA方法檢測尿樣、組織、飼料等樣本中的沙丁胺醇（Salbutamol，SAL），試劑盒由預(yù)包被偶聯(lián)抗原的酶標(biāo)板、辣根酶標(biāo)記物、抗體、標(biāo)準(zhǔn)品及其他配套試劑組成。檢測時，加入標(biāo)準(zhǔn)品或樣品溶液，樣本中的沙丁胺醇和酶標(biāo)板上預(yù)包被偶聯(lián)抗原競爭抗沙丁胺醇抗體，加入酶標(biāo)記物后，用TMB底物顯色，樣本吸光度值與其所含沙丁胺醇含量成負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出樣本中沙丁胺醇的殘留量。

2 技術(shù)指標(biāo)

2.1 試劑盒靈敏度：0.1ppb(ng/ml)

2.2 反應(yīng)模式：25℃，30min～15min

2.3 檢測下限：

尿液、組織………………………0.1ppb

飼料………………………………1ppb

2.4 交叉反應(yīng)率：

沙丁胺醇…………………………100%

鹽酸多巴酚丁胺…………………7.2%

西馬特羅…………………………0.1%

克倫特羅…………………………3.6%

萊克多巴胺………………………0.1%

腎上腺素…………………………0.1%

異丙腎上腺素……………………<1%

 2.5 樣本回收率：

尿樣……………………………………90%±10%

組織……………………………………80%±10%

飼料……………………………………80%±15%

3 試劑盒組成

酶標(biāo)板……………………………96孔

標(biāo)準(zhǔn)液：各1ml

0ppb、0.1ppb、0.3ppb、0.9ppb、2.7ppb、8.1ppb

高標(biāo)準(zhǔn)液（紅蓋）：100ppb………1ml

酶標(biāo)記物（紅蓋）…………………5.5ml

抗體工作液（藍(lán)蓋）………………5.5ml

底物液A（白蓋）……………………6ml

底物液B（黑蓋）……………………6ml

終止液（黃蓋）………………………6ml

20X濃縮洗滌液（白蓋）……………40ml

10X復(fù)溶液(黃蓋)…………………50ml

說明書………………………………1份

4 需要的器材和試劑

4.1 儀器：酶標(biāo)儀、打印機(jī)、均質(zhì)器 、氮?dú)獯蹈裳b置、振蕩器、離心機(jī)、刻度移液管、天平（感量0.01g）

4.2 微量移液器：單道20µl-200µl，100µl-1000µl、多道300µl

4.3 試劑：氫氧化鈉、乙酸乙酯、濃HCl、乙腈、異丙醇、正己烷、無水硫酸鈉 

5 樣本前處理

5.1 樣本處理前須知：

實(shí)驗(yàn)器具必須潔凈并使用一次性吸頭，以避免污染干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

5.2 配液：

配液1：1M鹽酸溶液

    稱取8.6ml濃HCl加去離子水至100ml。

配液2：1M NaOH 溶液

    稱取4g NaOH加去離子水至100ml。

配液3：復(fù)溶液

    將10×復(fù)溶液用去離子水10倍稀釋（1份濃縮復(fù)溶液+9份去離子水），用于樣本的復(fù)溶，復(fù)溶液在4℃環(huán)境可保存一個月。

5.3 樣本前處理步驟：

5.3.1 尿樣本處理方法

    直接取50µl清亮尿樣進(jìn)行測定（渾濁尿樣需要過濾或經(jīng)4000r/min離心5min，以得到清亮尿樣），暫不使用的樣本應(yīng)冷凍保存。

    尿樣本稀釋倍數(shù)：1    檢測下限：0.1ppb

5.3.2 組織樣本處理方法一：

   稱取均質(zhì)后的組織樣本2±0.05g ，加入6ml復(fù)溶液，充分振蕩2min，室溫4000r/min以上離心10min (若組織樣本中油脂含量較高，可在振蕩后放入85℃水浴10min后再離心)。取50µl上清液進(jìn)行分析。

樣本稀釋倍數(shù)：4    檢測下限：0.4ppb

5.3.3 組織樣本處理方法二：

1） 稱取均質(zhì)后的組織樣本2±0.05g ，加入1ml復(fù)溶液，振蕩混勻后加入4ml乙腈，振蕩混勻后加入1ml異丙醇，充分振蕩5min，室溫4000r/min以上離心10min；

2） 取上清液3ml，加入50ul 1M NaOH，加入7ml乙酸乙酯，充分振蕩5min，室溫4000r/min以上離心10min，取全部上清在56℃條件下氮?dú)饣蚩諝饬鞔抵?干燥；

3） 加入1ml 復(fù)溶液溶解干燥的殘留物，加入1ml正己烷混合30s ；15℃ 4000轉(zhuǎn)/分 以上離心5min。

4） 取50µl下層液進(jìn)行分析。

組織樣本稀釋倍數(shù)：1    檢測下限：0.1ppb

5.3.4 飼料樣本處理方法：

1）稱取均質(zhì)后的飼料樣品1.0±0.05g，加入10ml甲醇，再加入5g無水硫酸鈉，振蕩2min；室溫 4000r/min以上離心10min；

2）吸出離心后的上清液1ml，于56℃氮?dú)獯蹈桑? ml復(fù)溶液溶解干燥的殘留物，再加入1mL正己烷混合30s；室溫4000r/min以上離心5min。

3）取50µl下層進(jìn)行分析。

    樣本稀釋倍數(shù)：10    檢測下限：1ppb

6 酶聯(lián)免疫試驗(yàn)步驟

    將所需試劑從4℃冷藏環(huán)境中取出，置于室溫平衡30min以上, 洗滌液冷藏時可能會有結(jié)晶需恢復(fù)到室溫以充分溶解，每種液體試劑使用前均須搖勻。取出需要數(shù)量的微孔板及框架，將不用的微孔板放入自封袋，保存于2-8℃。

實(shí)驗(yàn)開始前，用去離子水將20×濃縮洗滌液按20倍稀釋成工作洗滌液。

6.1 編    號：將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)微孔按序編號，每個樣本和標(biāo)準(zhǔn)品做2孔平行，并記錄標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔所在的位置。

6.2 加樣反應(yīng)：加標(biāo)準(zhǔn)品或樣本50µl/孔到各自的微孔中，然后加酶標(biāo)記物50µl/孔，再加入50µl/孔的抗體工作液，用蓋板膜封板，輕輕振蕩5秒混勻，25℃反應(yīng)30分鐘。

6.3 洗    滌：小心揭開蓋板膜，將孔內(nèi)液體甩干，用工作洗滌液250µl/孔充分洗滌5次，每次間隔30秒，用吸水紙拍干（拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）。

6.4 顯    色：每孔加入底物液A 50µl，再加底物液B 50µl，輕輕振蕩5秒混勻，25℃避光顯色15分鐘。

6.5 終    止：每孔加入終止液50µl，輕輕振蕩混勻，終止反應(yīng)。

6.6 測吸光值：用酶標(biāo)儀于450nm處測定每孔吸光度值（建議用雙波長450/630nm）。測定應(yīng)在終止反應(yīng)后10分鐘內(nèi)完成。

7 結(jié)果分析

7.1 百分吸光率的計(jì)算

    標(biāo)準(zhǔn)液或樣本的百分吸光率等于標(biāo)準(zhǔn)液或樣本的百分吸光度值的平均值（雙孔）除以di一個標(biāo)準(zhǔn)液（0ppb）的吸光度值，再乘以100%，即

A—標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值

A0—0ppb標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值

7.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與計(jì)算

    以標(biāo)準(zhǔn)液百分吸光率為縱坐標(biāo)，對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)液濃度（ppb）的對數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)液的半對數(shù)曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對應(yīng)的濃度，乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中待測物的實(shí)際濃度。

    若利用試劑盒專業(yè)分析軟件進(jìn)行計(jì)算，更便于大量樣本的準(zhǔn)確、快速分析。

8 注意事項(xiàng)

8.1 室溫低于25℃或試劑及樣本沒有回到室溫（25℃）會導(dǎo)致所有標(biāo)準(zhǔn)的OD值偏低。

8.2 在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況，則會出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線不成線性，重復(fù)性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應(yīng)立即進(jìn)行下一步操作。

8.3 混合要均勻，洗板要*，在ELISA分析中的再現(xiàn)性，很大程度上取決于洗板的一致性。

8.4 在所有孵育過程中，用蓋板膜封住微孔板，避免光線照射。

8.5 不要使用過了有效期的試劑盒，不要交換使用不同批號試劑盒中的試劑。

8.6 顯色液若有任何顏色表明變質(zhì)，應(yīng)當(dāng)棄之。0標(biāo)準(zhǔn)的吸光度值小于0.5個單位（A450nm< 0.5 ）時，表示試劑可能變質(zhì)。

8.7 反應(yīng)終止液有腐蝕性，避免接觸皮膚。

9 貯藏及保存期

儲藏條件：試劑盒于2-8℃保存，避免冷凍。

保 質(zhì) 期：該產(chǎn)品有效期為1年，生產(chǎn)日期見包裝盒。